細胞名稱LLC(LL/2;LLC1)（小鼠肺癌細胞）

　　種屬小鼠年齡（性別）

　　組織來源肺

　　生長特性貼壁

　　細胞形態

　　上皮細胞樣

　　背景描述LLC細胞是小鼠Lewis肺癌細胞。

　　生長培養基DMEM高糖＋10%FBS＋1%P/S

　　培養條件氣相：空氣，95%；CO2，5%溫度：37℃

　　LLC[LL/2;LLC1]小鼠肺癌細胞培養說明書

　　一、細胞收到后處理

　　細胞在培養瓶中培養至良好狀態后灌滿完全培養液并封好瓶口是細胞運輸的辦法。收到細胞回到自己的實驗室后，先打開外包裝，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超凈臺內，嚴格無菌操作。鏡下觀察：未超過80%匯合度時，可將瓶裝的完全培養液移入廢液缸中，原瓶（T25瓶）保留6-8ml完全培養液，懸浮細胞需離心處理，放入37℃、5%CO2孵箱培養；超過80%匯合度時，根據情況傳代或者凍存，具體操作見細胞培養步驟。

　　二、細胞培養步驟

　　1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中，加入約6ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

　　2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

　　1、貼壁細胞，傳代參考如下：

　　①.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　②.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

　　③.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

　　④.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

　　2、懸浮細胞，傳代參考如下：

　　方法①：收集細胞，1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

　　方法②：可選擇半數換液方式，棄去半數培養基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

　　3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心5分鐘，去除上清，按凍存數量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

　　剛收到細胞時，胎牛血清可以用15%培養兩三天，利于細胞盡快恢復狀態，細胞穩定后再調回10%即可

　　收到細胞后如細胞狀態不佳，或培養中遇到問題，煩請當天盡快聯系，以便處理。當天及時反饋細胞情況和細胞照片是售后跟,蹤處理重要參考依據，請您務必重視。

　　"細胞培養三不要：

　　養科研細胞是生物醫學研究的基本功。有三個小經驗可以和大家分享一下：

　　1.不要燒瓶口。大多數人都喜歡在酒精燈的火焰上關瓶子，覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養基怎么越用越發紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。培養基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時候，熾熱的空氣進入瓶內。塞緊塞子放入冰箱后，空氣變冷，壓力驟降，培養基中的碳酸就會轉化成二氧化碳，釋放出來。培養基中的碳酸少了，當然會變jian。如果不燒瓶口的話，你會發現培養液變jian的速度會大大減慢。（當然多多少少還是會有一點越用越jian，因為室溫還是比冰箱內的溫度高）

　　其實燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下，你會發現根本就不會燒疼。如果有細菌的話，這么晃兩下也燒不死多少。要想燒死全部細菌，除非把瓶口和塞子燒紅。我在國內從來就不燒瓶口。來美國以后發現這里更徹底，超凈臺內根本就不點酒精燈。

　　2.不要頻繁看細胞。對于初學者而言，養細胞就像養孩子一樣，有空就要去看看。細胞越是養不好，就越是經常去看。實際上看細胞對細胞的生長沒有任何好處，特別是對原代細胞或是免疫磁珠分選后，密度特別低的細胞。培養基中的生長因子是非常有限的。細胞好不容易自分泌一點兒促生長的因子在其周圍，形成有利于生長的局部環境。你跑去看細胞，培養瓶這么一晃，把因子都給晃散了。經常可以看到新手一天到晚都在看細胞，細胞老是長不好。老手細胞一扔好幾天不管，細胞瘋長。

　　3.不要怕消化。

　　人源細胞系在傳代的時候，初學者往往生怕細胞消化過度，早早地終止消化。細胞沒下來就使勁吹燈，吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來，用力吹打對細胞的損傷比消化更大。我師兄在做血管平滑肌原代的時候，37度消化過夜，細胞也沒事。我一般是等細胞完全變圓后才中止消化。細胞輕輕一晃就能下來。還有，動作要輕柔，盡量不要產生氣泡。氣泡在破裂時的應力相當大，對細胞的傷害也是很大的。"詳見細胞說明書

　　傳代方法：建議1:2-1:3兩天換液一次